1. M u
Cụng ngh sinh hc thc vt ang cú nhiu úng gúp cú giỏ tr cho sn xut
nụng nghip, c bit trờn lnh vc to ging cõy trng mi. S ra i v phỏt
trin ca cỏc k thut sinh hc hin i nh nuụi cy mụ t bo thc vt, chn
dũng t bin, cụng ngh gen ang l cụng c cú hiu qu cao trong vic nghiờn
cu v ci tin cỏc ging cõy trng cú giỏ tr kinh t v ó thu c nhiu kt qu
trờn nhiu i tng cõy trng [1].
Vit nam cụng ngh sinh hc thc vt ang c nghiờn cu ng dng
trin khai trong cụng tỏc ging cõy trng v ó thu c nhng kt qu ỏng k
nh nhõn ging cõy sch bnh bng nuụi cy mụ, nuụi cy n bi, nuụi cy v
dung hp t bo trn, chn dũng t bo t bin trờn cỏc i tng cõy trng nh
lỳa, khoai lang, thuc lỏ, da si [9]. c bit Vin Cụng ngh sinh hc ó chn
to c hai ging lỳa DR1 v DR2 bng k thut chn dũng t bo mang bin d
soma cho nng sut cao v n nh, cú kh nng chu hn, chu lnh hn hn so
vi ging gc [10].
Lỳa l cõy lng thc quan trng nht trờn th gii, 90% din tớch lỳa trng
v tiờu th ch yu chõu Hin nay lỳa c trng trong nhng iu kin
sinh thỏi v khớ hu rt khỏc nhau c vựng nht i, ỏ nhit i v ụn i cỏc
chõu lc [3, 8].
Vit Nam l nc ng th hai trờn th gii v xut khu go, nhng giỏ tr
kinh t khụng cao, vỡ cht lng nhiu ging lỳa khụng ỏp ng c nhu cu ca
th trng. Trong khi ú chỳng ta cú nhng ging lỳa cht lng cao c sn rt
quớ, ht di, cm do v rt thm ngon nh Tỏm thm, D thm, T di hng
nhng nng sut thp vỡ cõy cao thõn mm, chng kộm, lỏ di, mng v r, ht
tha, thi gian sinh trng di, phn ng cht ch vi ỏnh sỏng ngy ngn [2, 7,
8].
Kt hp gia cụng ngh t bo thc vt, t bin thc nghim v cụng ngh
gen cho phộp ci bin cỏc ging lỳa núi trờn theo cỏc hng nh gõy t bin t
bo bng tia gamma v chn dũng t bo chn cỏc t bin thp cõy, chng
hoc s dng cụng ngh gen chuyn gen h thp chiu cao cõy.
Xut phỏt t c s trờn, chỳng tụi xõy dng ti: Nghiờn cu bin phỏp
cụng ngh sinh hc thc vt nhm gim chiu cao cõy v tng kh nng
chng ca cỏc ging lỳa cht lng cao. Vi mc ớch h thp chiu cao
1
cõy, tng cng tớnh chng ci thin nng sut, rỳt ngn thi gian sinh
trng ca ging lỳa Tỏm thm, D thm v T di hng.
2
2. Tổng quan tài liệu
2.1. Các giống lúa chất lợng cao ở miền Bắc Việt Nam
ở nớc ta cây lúa luôn giữ vị trí trọng yếu trong hệ thống các cây trồng nông
nghiệp. Ngày nay khi mà lúa gạo đã có đủ cho nhu cầu trong nớc và có d để xuất khẩu
thì vị trí của các giống lúa chất lợng cao đặc sản ngày càng quan trọng.
Nhu cầu sử dụng các giống lúa chất lợng cao đặc sản ngày một gia tăng, trong khi
đó hầu hết các giống lúa này đang trong tình trạng bị thoái hoá, chất lợng gieo trồng
thấp, kỹ thuật canh tác cha phù hợp nên sản phẩm cha đạt yêu cầu chất lợng nh mong
muốn. Các giống lúa chất lợng cao nh Tám xoan, Tẻ di hơng, Dự thơm, Nàng hơng là
giống lúa đặc sản vùng đồng bằng Bắc bộ có phẩm chất gạo rất tốt và có mùi thơm ngon,
nhng năng suất thấp do có nhiều đặc điểm yếu nh cao cây, thân yếu chống đổ kém, kém
chịu phân, lá dài rủ, hạt tha, cổ bông dài, trong đó tính trạng cần khắc phục nhất là cao
cây [7, 8].
Các giống lúa chất lợng thuộc nhóm lúa mùa chính vụ có thời gian sinh trởng dài
150-160 ngày, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn, biên độ thời vụ khá rộng. Hiện
nay có khoảng 12 giống lúa Tám đợc trồng ở miền Bắc nớc ta, trong đó các giống chất l-
ợng cao nổi tiếng nhất nh: Tám xoan Hải Hậu, Tám ấp bẹ Xuân Đài, Tám cổ ngỗng Nam
định. Các giống này thờng đợc trồng ở vùng Thái Bình, Nam định, Hải Dơng, Hải
Phòng Các giống lúa Dự thơm, Tẻ di hơng cũng là những giống lúa đặc sản nổi tiếng đ-
ợc trồng nhiều ở các tỉnh ven biển đồng bằng Bắc bộ, hiện nay đợc chú ý khôi phục trở
lại do tính chất chịu mặn, chịu chua phèn, gạo dự hơng đợc coi là loại gạo đặc sản dùng
trong ngày lễ, ngày tết [8].
Hầu hết các giống lúa chất lợng cao đang trồng ở miền Bắc nớc ta đều cao cây,
chống đổ kém và đợc trồng vào vụ mùa, đây là mùa ma nhiều. Nên vào giai đoạn gần thu
hoạch các giống này do cao cây chống đổ kém nên dễ bị khi gặp gió và ma, vì vậy hạt lúa
dễ bị mọc mầm, ảnh hởng đến chất lợng và năng suất. Tính trạng qui định chiều cao cây
là do đa gen qui định và chịu ảnh hởng của điều kiện môi trờng. Việc nghiên cứu các
biện pháp để giảm chiều cao cây có ý nghĩa rất lớn không chỉ đối với các giống lúa chất
lợng cao mà còn có ý nghĩa đối với các giống cây trồng khác nh lúa nếp, lúa tẻ, các giống
ngô.
2.2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Cơ sở chọn dòng biến dị soma trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để
phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [1].
Soma là tên gọi các tế bào sinh dỡng, nó khác với tế bào sinh dục. Biến dị soma
dùng để chỉ tất cả các biến dị xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào. Từ các tế bào
soma có thể tạo nên bất kỳ bộ phận nào của cây hay cây hoàn chỉnh thông qua kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nguyên lý chung của việc chọn dòng mang biến dị soma là
các tế bào nuôi cấy in vitro có tỷ lệ biến dị di truyền lớn (10
-5
-10
-8
), nếu kết hợp xử lý đột
3
biến hoặc xử lý stress thì tần số có thể tăng lên gấp 10 lần, vì thế có thể chọn đợc các cá
thể đột biến nhanh hơn và có hiệu quả hơn so với các phơng pháp chọn giống thông th-
ờng khác áp dụng cho cây nguyên vẹn. ở mức độ tế bào, nhất là tế bào đơn bội hầu nh
những đặc điểm đột biến đợc thể hiện ra ngay. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào còn cho phép
giảm bớt đáng kể thời gian cần thiết để chọn đợc những tính trạng theo ý muốn [1].
Theo Lê Trần Bình và CS. (1997), bản chất và cơ chế của biến dị soma liên quan mật
thiết đến những thay đổi trong genome của tế bào nuôi cấy. Do nhiều nguyên nhân nh tác
động của hocmon sinh trởng trong thời gian dài và các yếu tố khác làm cho nhiễm sắc thể
trong tế bào nuôi cấy có thể tăng lên tạo ra các dạng đa bội lệch và mức bội thể cao. Nhiều
trờng hợp các, các đoạn của nhiễm sắc thể đợc chuyển đổi hoặc đảo ngợc. Cấu trúc của phân
tử DNA cũng có thể bị thay đổi dẫn đến đột biến kiểu hình thực sự.
Tơng tự nh vậy, nhiều công trình công bố cũng cho rằng biến dị soma thờng xuất
hiện ở các cây tái sinh đợc sau khi nuôi cấy tế bào qua giai đoạn mô sẹo [14], có nhiều
kiểu đột biến nh: đột biến nhân, đột biến tế bào chất, đa bội thể và các bất thờng khác
trong nhiễm sắc thể [25].
Những ứng dụng lớn nhất trong việc chọn dòng mang biến dị soma của công tác
giống chính là chọn ra các kiểu hình với các kiểu gene tơng ứng, thích hợp với yêu cầu
của các giống mới là có năng suất cao, chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi,
chất lợng tốt và ổn định. Nhiều công trình công bố đã thành công trong việc chọn dòng
mang biến dị soma trên các đối tợng giống cây trồng, ở thuốc lá, nuôi cấy hạt phấn và tế
bào trần đã thu đợc những cây đột biến có năng suất cao, thời gian sinh trởng ngắn, hàm
lợng đờng và alkaloid thấp [1].
2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo và sự biến dị di tryuền
Mô sẹo (callus) là khối mô thực vật gồm những tế bào không phân hoá, có khả
năng phân bào liên tục. Trong tự nhiên, mô sẹo thờng phát sinh trên vết thơng ở cây vì
vậy có tên gọi theo nghĩa đen là mô sẹo.
Bởi vì mô sẹo là một khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc thấp, cha phân
hoá nhng phân chia một cách hỗn loạn và thờng có tính biến động di truyền cao. Trong
nuôi cấy in vitro mô sẹo đợc tạo ra bằng cách nuôi cấy các cơ quan của thực vật (thân, rễ,
lá, hoa, quả ) ở các môi trờng chứa chất điều khiển sinh trởng cần thiết (auxin,
cytokinin) và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Khi tái sinh cây từ những mô sẹo đợc cấy
chuyển nhiều lần, thì những cây này dễ mang những biến động di truyền về nhiễm sắc
thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác [1].
Đối với việc chọn dòng biến dị soma, những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến
dị di truyền có một ý nghĩa rất lớn, từ đây ta có thể chọn ra đợc nhiều dòng cây mang
những đặc điểm khác nhau so với giống ban đầu. Vấn đề này đã mở ra một triển vọng
trong việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật để cải tiến di truyền những giống cây trồng
có ý nghĩa kinh tế.
2.2.3. Tái sinh cây từ mô sẹo
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, kỹ thuật tạo, nuôi và tái sinh cây từ mô sẹo
phải đợc hoàn thiện một cách tối u nhất, trong đó đặc biệt là vấn đề tái sinh cây. Nhiều
4
tác giả sau khi chọn đợc dòng tế bào đột biến từ nuôi cấy mô sẹo đã không tái sinh đợc
cây hoặc những cây này lại không duy trì đợc tính trạng vừa chọn lọc.
ở một vài loại cây cho hạt quan trọng, việc tái sinh chồi từ mô sẹo còn gặp nhiều
khó khăn. ở các đối tợng thuộc họ Fabacaea việc tái sinh cây hoàn chỉnh cho tới nay chỉ
thành công trong một số trờng hợp chẳng hạn Archis hypogaea, Onobrychis viciifolia
Nuôi cấy mô sẹo của thuốc lá sau nhiêu lần cấy chuyển vẫn duy trì đợc khả năng tái sinh
[18].
Theo Amirato và cs (1984) nguồn gốc mô sẹo cũng ảnh hởng đến khả năng tái
sinh cây, chẳng hạn ngời ta chỉ thu đợc cây tái sinh từ mô sẹo nuôi cấy bằng đoạn hoa tự
của lúa mì. Mức bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây sự khác nhau trong quá
trình tái sinh cây, mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hoặc mảnh lá của Datura innoxia tạo chồi
nhanh hơn mô sẹo cùng loài của cây nhị bội.
Theo Sharp (1984) năm 1951-Levine là ngời đầu tiên đã thành công trong việc tạo
mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo của Nicotiana affinis và Helianthus annuus, đến nay ng-
ời ta đã tạo và tái sinh cây thành công từ mô sẹo trên hơn 100 loài.
2.3. Đột biến thực nghiệm và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng
Tính ổn định trong cấu trúc di truyền ở cá thể sống không phải là tuyệt đối, nó có
thể bị biến đổi do tác động của các tác nhân vật lý và hoá học. Ngời ta gọi những biến
đổi nhỏ nhất trong cấu trúc gen hoặc nhiễm sắc thể là đột biến [11].
Cùng với tác nhân gây đột biến là các tác nhân hoá học, thì các tác nhân vật lý
(chiếu xạ bởi tia Rơnghen, tia Gamma, bức xạ Neutron ) là những tác nhân gây đột biến
có hiệu quả giúp con ngời tạo ra hàng loạt giống mới có những thuộc tính mới có lợi về
mặt kinh tế: thấp cây, thời gian sinh trởng ngắn, năng suất cao, chất lợng dinh dỡng tốt,
đề kháng với sâu bệnh [5].
Đối với chiếu xạ tia Gamma thờng dùng nguồn là Co
60
hoặc Cs
137
có hoạt tính
phóng xạ, tuỳ từng đối tợng cụ thể có thể sử dụng 2 cách chiếu xạ: (1). Chiếu xạ nhanh
trong một thời gian ngắn bằng nguồn mạnh và cờng độ chiếu xạ mạnh, (2). Chiếu xạ từ từ
bằng nguồn yếu và thời gian chiếu xạ kéo dài.
2.3.1. Cơ chế gây đột biến khi chiếu xạ
Dựa vào tính chất biến đổi cấu trúc di truyền mà ngời ta chia đột biến thành hai kiểu
cơ bản: Đột biến gen (còn gọi là đột biến điểm) và đột biến nhiễm sắc thể.
- Đột biến gen là những biến đổi trong cấu trúc phân tử của gen, tức là nó thay đổi trật
tự các nucleotid trong DNA hoặc thay thế các bazơ nitơ trong các cặp nucleotid.
- Đột biến NST là những đột biến làm đứt và thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể, vì thế nó
làm thay đổi nhiều dấu hiệu hay các đặc tính khác nhau của cơ thể. Ngoài ra còn loại
đột biến nữa là sự tăng hoặc giảm một số lần bộ nhiễm sắc thể, gọi là đa bội thể.
Khi chiếu xạ bằng tia Gamma từ nguồn Co
60
lên tế bào hoặc mô thì các phân tử sinh
học chịu tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hoá.
5
- Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp ion hoá và kích thích các phân tử sinh học làm tổn th-
ơng các phân tử đó, đối với vật chất di truyền xảy ra các hiệu ứng sau: (1) Thay đổi thành
phần cấu tạo của DNA: đứt liên kết photphodieste giữa các phân tử đờng, phá huỷ liên
kết bazơ - đờng, thay đổi cấu trúc bậc 2 của DNA (đứt đoạn, biến tính, kết hợp chéo). (2).
ảnh hởng lên sự sao chép DNA - RNA. (3) Tay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể: đứt đoạn,
mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, trao đổi chéo, thay đổi mức bội thể.
- Tác dụng gián tiếp: bức xạ ion hoá tác dụng lên các phân tử nớc với ion H
+
, OH
-
, các
gốc tự do OH
.
, H
.
và các sản phẩm oxy hoá mạnh nh H
2
O
2
. Các sản phẩm kể trên của
quá trình xạ phân (Radiolyse) nớc rất hoạt động về mặt hoá học, chúng sẽ công phá
các phân tử sinh học làm thay đổi cấu trúc chức năng của chúng.
Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái cũng nh thay đổi chức năng trong tế bào
và mô. Nhng bức xạ không tạo ra chức năng mới trong tế bào và mô mà chỉ làm thay đổi
các chức năng sẵn có hay làm xuất hiện các chức năng trớc đó tiềm tàng [5, 11].
2.3.2. Một số thành tựu của chọn giống đột biến
Công tác chọn giống và tạo giống mới có vai trò hết sức quan trọng trong việc
tăng năng suất và chất lợng cây trồng đặc biệt là cây lơng thực. Chính công tác này đã
đóng vai trò quyết định trong cuộc cách mạng xanh trong những năm 1960 ở ấn Độ và
nhiều nớc khác trên thế giới [5]. Một trong những thành tựu xuất sắc nhất của thế kỷ 20
là khám phá ra phơng pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm. Với kết quả
của hơn 60 nớc đã thu đợc chứng tỏ đây là phơng pháp có hiệu quả để tạo giống mới.
Theo thống kê của Tổ chức lơng thực và Tổ chức năng lợng nguyên tử thế giới
(FAO/IAEA) năm 1960 chỉ có 7 giống cây trồng đột biến, 1975 có 145 giống, 1992 có
1530 giống, năm 1997 có 1870 giống. Phần lớn các giống tạo ra là cây ngũ cốc nh: lúa,
lúa mì, lúa mạch, ngô Các nớc tạo ra nhiều giống đột biến nh: Trung Quốc, ấn Độ,
Nhật Bản, các nớc Liên Xô cũ [11].
Từ năm 1968, Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu chọn giống đột biến và đã thu đợc
kết quả đáng kể nh tạo ra các giống lúa A-20, DT10, DT-11, DT13, giống ngô DT-6, đậu
tơng DT84, DT-90 (Quý1997) Gần đây Nguyễn Minh Công và cộng sự đã tạo đợc
giống Tám thơm đột biến không cảm quang, có thể gieo cấy đợc cả hai vụ [2].
2.4. Chuyển gen ở thực vật và thành tựu trong cải tạo giống cây trồng
2.4.1. Các phơng pháp chuyển gen ở thực vật
Hiện nay có nhiều phơng pháp chuyển gen ở thực vật đã đợc nghiên cứu và thành
công trên nhiều đối tợng cây trồng. Những thành công chuyển gen đầu tiên đợc tiến hành
bằng các phơng pháp xung điện hay sử dụng polyethylene glycol. Sử dụng súng bắn gen
để chuyển các gen mong muốn vào mô sẹo cho tỷ lệ tái sinh cao đã thành công trong
chuyển gen vào phôi non bằng cách lây nhiễm với Agrobacterium [23, 24].
Hai phơng pháp chuyển gen thành công nhất là chuyển gen trực tiếp bằng súng
bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium:
- Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen: Đây là một trong những phơng pháp đa các
gen ngoại lai vào tế bào do Sanford, 1990 đa ra. Phơng pháp này đợc áp dụng với những
6
đối tợng mà việc chuyển gen bằng Agrobacterium khó thực hiện đợc (do không mẫn cảm
với Agrobacterium) hay khả năng tái sinh kém (khi chuyển gen vào tế bào trần) [15]. Ph-
ơng pháp này đợc sử dụng rộng rãi sau phơng pháp chuyển gen qua Agrobacterium với
các u và nhợc điểm sau [16]:
+ Ưu điểm: Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô và tế bào, chuyển DNA ngoại
lai vào tế bào nhanh, dễ sử dụng với quy trình đơn giản, một số lợng lớn mẫu có thể đợc
xử lý trong thời gian ngắn, các vecto đợc thiết kế đơn giản: không đòi hỏi các trình tự
DNA cho đoạn T-DNA nh chuyển gen bằng Agrobacterium, cần một lợng nhỏ plasmid
DNA, biểu hiện gen tạm thời có thể đợc quan sát sau vài ngày
+ Nhợc điểm: Nhiều bản sao vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc phân
tích chọn lọc về sau này, hiệu quả chuyển gen vẫn còn thấp, chi phí cao [23].
- Phơng pháp chuyển gen bằng Agrobacterium: Đây là phơng pháp chuyển gen đợc sử
dụng rộng rãi nhất, có hiệu quả cao với số bản copy chuyển vào tế bào thực vật thấp [30].
Phơng pháp chuyển gen bằng Agrobacterium thờng đợc dùng cho các loại cây hai lá mầm
vì Agrobacterium mẫn cảm với các loại cây này. Tuy nhiên, ngày nay ngời ta đã tìm ra
các chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây một lá mầm trong đó có ngô, lúa và các cây
chuyển gen hữu thụ đã nhận đợc [21, 23]. Chuyển gen bằng Agrobacterium đã đợc
nghiên cứu thành công bởi nhiều tác giả, các yếu tố ảnh hởng tới hiệu quả chuyển gen đã
đợc tối u hoá nh chủng Agrobacterium, kiểu gen của từng loài, giống, thành phần môi tr-
ờng nuôi cấy, nhiệt độ ) [24].
Một nghiên cứu gần đây ở đậu tơng đã kết hợp hai phơng pháp dùng súng bắn gen
và Agrobacterium: trớc khi lây nhiễm mô bằng Agrobacterium mô đợc làm bị thơng bằng
cách bắn đạn không mang gen. Phơng pháp này có thể cho hiệu quả lây nhiễm cao, bởi
sau khi bị bắn mô tạo phản ứng đối với vết thơng, tạo điều kiện cho lây nhiễm bằng
Agrobacterium [19].
2.4.2. Gibberellin và ứng dụng chuyển gen ức chế tổng hợp gibberellin
2.4.2.1. Vai trò sinh lý gibberellin
Gibberellin (GA) là phytohoocmon tồn tại ở trong các bộ phận của cây, hiện nay
ngời ta đã phát hiện đợc hơn 50 loại gibberellin, trong đó có GA3 (axit gibberellic) có
hoạt tính mạnh nhất. Tất cả các GA đều có cùng một vòng gibban cơ bản, còn điểm khác
nhau nhỏ giữa chúng chủ yếu là vị trí của nhóm - OH trong phân tử.
Gibberellin đợc tổng hợp ở trong các cơ quan đang sinh trởng nh hạt nảy mầm, lá
non, quả non trong đó sự tổng hợp mạnh nhất là ở tế bào lục lạp. GA đợc tổng hợp từ
mevalonat qua hàng loạt các phản ứng dẫn đến hợp chất trung gian quan trọng là kaurent
cơ sở của tất cả các GA trong cây.
Vai trò sinh lý của GA đã đợc nghiên cứu trên nhiều đối tợng. GA kích thích sự
nảy mầm của hạt và củ, kích thích sự ra hoa và phân hoá giới tính, làm tăng kích thớc quả
và tạo quả không hạt.
Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trởng kéo dài
của thân, sự vơn dài của lóng cây họ lúa do kích thích đặc trng của GA lên pha giãn tế
bào theo chiều dọc [12].
2.4.2.2. ứng dụng chuyển gen ức chế tổng hợp Gibberellin
Những nghiên cứu gần đây cho thấy quá trình tổng hợp và điều hoà hoạt động của
GA là do gen qui định. Các nghiên cứu về trao đổi chất di truyền của GA đã khẳng định
7
rằng các đột biến lùn của một số thực vật nh ngô, đậu Hà lan (chiều cao cây chỉ bằng
khoảng 20% chiều cao cây bình thờng) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu hụt
các enzym trên con đờng tổng hợp GA mà cây không thể hình thành đợc GA. Với những
đột biến này thì việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho cây sinh trởng bình thờng [12].
Theo thông báo của Goodman ở cây A. thaliana gen GA2 nằm trên nhiễm sắc thể
số 1 và có chiều dài là 2506 base [32], khi GA2 bị đột biến thì thiếu sự tổng hợp của chất
trung gian ent-kaurent B dẫn đến làm thay đổi hoạt động của enzym để chuyển từ
Copalyl pyrophosphate sang ent-kaurene ở giai đoạn đầu của quá trình sinh tổng hợp GA.
Theo Meier C. và CS. (2001) ở cây A. thaliana còn có gen lùn đột biến - lue1, gen này
cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 1 và gần vị trí của gen GA2, cây có gen lùn đột biến lue1
có chiều cao chỉ bằng 30% so với cây đối chứng và các chồi thứ cấp cũng bị giảm.
Nghiên cứu gần đây đã thành công chuyển gen ức chế hoạt động của GA2-oxidase
(AtGA2-ox) ở cây A. thalinia, cây đợc chuyển gen AtGA2-ox có chiều cao cây thấp hơn
hẳn so với đối chứng [29].
Hahn và CS. [2000] nghiên cứu ở lúa có gen nửa lùn Sd-1 nằm trên nhiễm sắc thể
số 1, Sd-1 là gen đơn lặn làm giảm chiều cao cây lúa và đợc sử dụng rộng rãi để tăng khả
năng chống đổ, nâng cao năng suất.
2.4.3. Các thành tựu của chuyển gen tạo giống cây trồng
Ngày nay kỹ thuật chuyển gen đã đợc áp dụng rộng rãi trong việc chuyển các gen
hữu ích vào các giống cây trồng, đặc biệt là các cây 2 lá mầm. Lợi nhuận thu đợc từ trồng
giống ngô chuyển gen Bt tăng 99 triệu USD và tiết kiệm đợc 216 triệu USD do giảm chi
phí thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu khi trồng đậu tơng Roundup ready và bông Bt (Nguồn:
Trung tâm chính sách Nông nghiệp thực phẩm 01/2001).
Tính đến năm 1996 đã có khoảng 2000 dòng cây chuyển gen khác nhau đã đợc
tạo ra ở Mỹ, 250 dòng cây chuyển gen đợc tạo ra ở châu Âu, trong đó có 1030
giống/dòng ngô, 325 giống/dòng cà chua, 279 giống/dòng đậu tơng, 265 giống/dòng
khoai tây và 193 giống/dòng bông. Trong số các cây đợc tạo ra bằng con đờng chuyển
gen này có 761 giống/dòng cây kháng thuốc diệt cỏ, 252 dòng kháng virus, 676 dòng
kháng côn trùng, 106 dòng kháng bệnh, 738 dòng mang tính trạng chất lợng và 199 dòng
mang các tính trạng khác (Nguồn: Transgene Nutzpflanzen, 1999).
Trên thế giới các giống cây chuyển gen đợc trồng trên diện tích 44,2 triệu ha vào năm
2000, chiếm 16% tổng diện tích các cây trồng chính. ở các nớc đang phát triển, diện tích
khảo nghiệm các giống chuyển gen chiếm 15% tổng diện tích trồng cây chuyển gen.
Diện tích trồng các cây chuyển gen dự kiến sẽ tiếp tục tăng trong thời gian tới.
Các nớc trồng cây chuyển gen chính là Mỹ, Argentina, Canada và Trung quốc.
Mỹ là nớc công nghiệp đầu tiên cho phép sản xuất cây chuyển gen làm thức ăn vào năm
1994 với giống/dòng cà chua mang gen chín chậm Flavr-Savr
TM
. Tiếp theo đó các cây
chuyển gen đã đợc trồng trên quy mô lớn vào năm 1996.
Trung quốc là nớc đầu tiên thơng mại hoá cây chuyển gen vào những năm đầu của
thập kỷ 90 với các giống thuốc lá, khoai tây kháng virus và các giống bông chuyển gen
Bt kháng sâu. Tính đến năm 1999 Trung Quốc đã trồng đợc 2,0 triệu ha các giống bông
chuyển gen Bt và 8 giống bông đã đợc thơng mại hoá.
(Nguồn: Transgene Nutzpflanzen, 1999)
8
3. Mục đích của luận án
- Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào kết hợp với đột biến thực nghiệm để chọn tạo ra
các dòng lúa thấp cây.
- Xây dựng qui trình chuyển gen hạ thấp chiều cao cây ở lúa.
- Thu đợc các dòng cây chuyển gen hạ thấp chiều cao cây.
4. Điểm mới của luận án
Đây là công trình nghiên cứu sử dụng kết hợp giữa công nghệ tế bào thực vật, đột
biến mô sẹo lúa và phơng pháp chuyển gen để hạ thấp chiều cao cây của các giống lúa
chất lợng cao.
5. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
5.1. Vật liệu
- Các giống lúa đặc sản của Việt Nam: Tám xoan, Tám ấp bẹ, Dự thơm, Tẻ di hơng, do
Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật, Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt nam
cung cấp.
- Vector pCAMBIA1301 và Promoto 35S do tổ chức CAMBIA, australia cung cấp.
- Các hoá chất, enzim sử dụng của các hãng Sigma, Biolab, Invitrogen
5.2. Phơng pháp
Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
9
Kiểm tra
bằng kỹ
thuật sinh
học phân tử
Chọn lọc
dòng u
tú và khảo
nghiệm
Theo dõi và
chọn lọc
trên đồng
ruộng
Tái
sinh
cây
(1). Xử lý đột
biến
(2). Chuyển
gen
Tạo
mô
sẹo
Hạt
lúa
chín
5.2.1. Phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Tạo mô sẹo
- Xử lý mô sẹo
- Tái sinh cây
- Tạo cây hoàn chỉnh và đa ra đồng ruộng
5.2.2. Phơng pháp xử lý phóng xạ
- Mô sẹo đợc tạo ra sao 3 tuần đợc xử lý phóng xạ Co
60
ở các liều lợng khác nhau (5krad,
10krad, 15krad, 20krad), xác định ngỡng chiếu xạ hợp lý đối với từng giống.
- Chọn lọc mô sẹo sống sót và tái sinh cây
5.2.3. Phơng pháp chuyển gen
- Thiết kế vector chuyển gen mang gen hạ thấp chiều cao cây (ký hiệu atGA)
+ Tách dòng gen atGA
+ Xác định trình tự gen atGA
+ Thiết kế cấu trúc gen (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) + đoạn kết thúc)
+ Đa cấu trúc (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) + đoạn kết thúc) vào vector
chuyển gen
- Chuyển gen
- Kiểm tra sự có mặt của gen trong cây: PCR, lai Southern, lai Western
5.2.4. Phơng pháp nghiên cứu trên đồng ruộng
- Cây từ ống nghiệm đa ra ngoài đồng ruộng (thế hệ R0) đợc cấy 1 dảnh và đợc gọi là 1 dòng.
Bông của mỗi dòng thu đợc đánh dấu và thu hoạch riêng để gieo trồng cho vụ tiếp theo.
- Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn phát triển trong mỗi vụ
gieo trồng. Phân tích các đột biến và thu nhận các dòng có các đột biên có lợi, đánh giá
các chỉ tiêu nông sinh học của các dòng chọ lọc theo các chỉ tiêu nông sinh học:
- Chiều cao cây
- Số bông trên khóm
- Chiều dài bông
- Số hạt chắc trên bông
- Chiều dài hạt
- Chiều rộng hạt
- Trọng lợng 1000 hạt
- Thời gian sinh trởng
- Đặc điểm hình thái của bộ lá và lá đòng
- Khả năng chống đổ
5.2.5. Phơng pháp đánh giá tính đa hình DNA
- Tách DNA tổng số từ lá
- Xác định hàm lợng và độ sạch DNA
- So sánh RAPD và phân tích số liệu RAPD
10
5.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Các máy móc, thiết bị chuyên dụng cho nuôi cấy mô và nghiên cứu sinh học phân tử
của phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng máy chung thuộc Viện Công nghệ sinh
học nh máy PCR, máy điện di, máy ly tâm, máy đo quang phổ
11
6. Nội dung nghiên cứu
+ Chọn dòng đột biến:
- Thu thập và nhân hạt giống gốc để làm nguyên liệu
- Xây dựng hệ thống tạo mô sẹo và tái sinh tối u đối với các giống lúa Tám.
- Xác định liều lợng chiếu xạ đối với mô sẹo lúa bằng tia Gamma Co
60
- Xác định sự đa dạng di truyền của các giống lúa Tám thơm và các dòng chọn lọc
bằng kỹ thuật RAPD
- Xử lý đột biến mô sẹo, tái sinh cây
- Trồng và theo dõi các dòng thu đợc trên đồng ruộng
- Phân tích các đột biến của các dòng thu đợc
- Chọn lọc các dòng đột biến thấp cây và đa trồng thử nghiệm.
+ Chuyển gen:
+ Tách dòng gen atGA
+ Xác định trình tự gen atGA
+ Thiết kế cấu trúc gen (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) + đoạn kết thúc)
+ Đa cấu trúc (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) + đoạn kết thúc) vào vector
chuyển gen
+ Chuyển gen atGA vào mô sẹo lúa
- Kiểm tra sự có mặt của gen trong cây: PCR, lai Southern, lai Western
- Trồng và theo dõi các dòng cây chuyển gen trong nhà lới
12
7. Dự kiến sơ bộ về việc thực hiện đề tài
7.1. Nơi thực hiện đề tài
Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Kết hợp với một
số cơ quan khác: Trại thí nghiệm của Viện CNSH, Trung tâm chiếu xạ quốc gia - Từ
Liêm, Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng trung ơng
7.2. Thời gian thực hiện
- 2001: - Thu thập hạt giống gốc
- Nhân hạt giống để làm nguyên liệu
- Xác định liều lợng chiếu xạ hợp lý đối với mô sẹo lúa
- 2002:
- Tạo mô sẹo, xử lý đột biến mô sẹo, tái sinh cây
- Trồng và theo dõi các dòng thu đợc (thế hệ R0) trên đồng ruộng
- Phân tích các đột biến thấp cây của các dòng thu đợc
+ Tách dòng gen qui định thấp cây ở lúa (ký hiệu atGA)
+ Xác định trình tự gen atGA
- 2003: - Tiếp tục trồng, theo dõi và phân tích các dòng cây đột biến thấp
cây ở thế hệ R1
+ Thiết kế cấu trúc gen (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) +
đoạn kết thúc)
+ Đa cấu trúc (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) + đoạn kết
thúc) vào vector chuyển gen
+ Chuyển gen hạ thấp chiều cao cây atGA
- 2004: - Chọn lọc và trồng các dòng đột biến thấp cây thế hệ R2
- Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng đột biến thấp cây
- Kiểm tra sự có mặt của gen atGA trong cây: PCR, lai Southern
- Trồng và theo dõi các dòng cây chuyển gen trong nhà lới
- Viết và hoàn thành luận án
7.3. Kinh phí nghiên cứu:
Dựa vào kinh phí đào tạo của Bộ Giáo dục và Đào tạo, các đề tài cấp Nhà nớc, cấp
Bộ và cấp Cơ sở của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.
13
Tài liệu tham khảo
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997). Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến
giống cây trồng (giáo trình cao học nông nghiệp), NXB Nông nghiệp, Hà nội.
2. Nguyễn Minh Công, Đỗ Hữu ất, Bùi Huy Thuỷ, (1999). Nghiên cứu chọn tạo giống lúa tám
thơm đột biến. Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm, số 5/1999, 212-213.
3. Bùi Huy Đáp, (1999). Một số vấn đề về cây lúa. NXB Nông nghiệp - Hà nội, 154tr.
4. Trơng Đích, (1999). 265 giống cây trồng mới. NXB Nông nghiệp - Hà nội, 323tr.
5. Phan Văn Duyệt, (1998). Phơng pháp vật lý và lý sinh phóng xạ dùng trong nông nghiệp,
sinh học và y học. NXB Khoa học và kỹ thuật - Hà nội, 177tr.
6. Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, IRRI, INGRE-1996.
7. Nguyễn Văn Hiển, Trần Thị Nhàn, (1982). Giống lúa miền Bắc Việt nam. NXB Nông nghiệp - Hà nội, 203tr.
8. Nguyễn Văn Hoan, (1997). Hớng dẫn kỹ thuật tâm canh các giống lúa chuyên mùa chất lợng
cao. NXB Nông nghiệp - Hà nội, 87tr.
9. Nguyễn Hoàng Lộc (1992). Chọn dòng chịu muối NaCl và chịu mất nớc ở thuốc lá
(Nicotiana tabacum L.) (luận án Phó tiến sĩ sinh học), Hà nội.
10. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Văn Tĩnh, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998). Kết quả chọn tạo và triển khai
sản xuất hai giống lúa mới DR1 và DR2 bằng công nghệ tế bào thực vật. Tạp chí Khoa Học và Công
Nghệ, Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, tập XXXVI, số 4.
11. Trần Duy Quý, (1997). Các phơng pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng. NXB Nông
nghiệp - Hà nội, 348tr.
12. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1997). Sinh lý học thực vật. NXB Giáo dục, 251 tr.
Tài liệu tiếng nớc ngoài
13. Amirato P.V., Evans D.A., Sharp W.R. and Yamada Y. (1984). Handbook of plant cell
culture. Crop Species, New York, Macmilan.Vol. 3.
14. Bartels D., Singh M., Salamini F. (1988). Onset of desiccation tolerance during development
of the barley embryo. Planta Mol. Biol. 11, 277-291.
15. Brown et al. (1994). Development of simple bombardment device for gene transfer into plant
cells. Plant Cell Tissue Organ Cul., 37, 47-53.
16. Casas, A.M. et al (1995). Cereal transformation through particle bombardment. Plant Breed.
Rev., 13, 235-264.
17. Claes B., Dekeyser R., Villarroel R., Bulcke V.D.M., Baum G., Montagu M.V. (1990).
Characterization of a rice gene showing organ-specific expression in response to salt stress
and drought. Plant Cell 2, 19-27.
18. Dix P.J. (ed) (1990). Plant cell line selection (Procedures and applications) VCH
Verlagsgellschft MBH.
19. Droste A., Pasquali G., Zanettini M.H.B. (2000). Intergratd bombardment and
Agrobacterium transformation system: an alternatve method for Soybean transformation.
Plant molecular biology reporter 18: 51-59.
20. Goodman, H. M. http://crstel.nal.usda.gov:8080
21. Hadi MZ, McMullen MD and Finer JJ (1996). Transformation of 12 different plasmids into
soybean via particle bombardment. Plant Cell Rep 15: 500-505.
14
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét